Le diagnostic de neuropathie optique héréditaire de Leber est suspecté devant une baisse d'acuité visuelle dans la fratrie d'une personne atteinte. Elle peut l'être également face à une neuropathie optique chez un sujet jeune, surtout un sujet de sexe masculin, sans antécédent. Il s'agit d'un diagnostic d'élimination. La recherche de diagnostics différentiels s'impose dans tous les cas, y compris en cas de présence d'une mutation de l'ADN mitochondrial, retrouvée chez des porteurs sains. C'est l'intérêt de l'imagerie multimodale et de l'électrophysiologie permettant d'éliminer une pathologie rétinienne mimant une neuropathie optique. Un bilan neuroradiologique doit être systématique pour éliminer une cause compressive et/ou une hypertension intracrânienne. Ce bilan renseigne également sur un éventuel hypersignal du nerf optique dont l'aspect peut être un argument d'orientation vers différentes causes de névrites optiques. Enfin, il faut éliminer une cause carentielle ou toxique.