IntroductionUne quantification fiable de la viabilité endothéliale est primordiale dans l’évaluation expérimentale de toute nouvelle procédure (nouveaux milieux ou procédés de conservation) susceptible de modifier l’endothélium cornéen. La mesure de la densité cellulaire endothéliale (DCE) seule ne renseigne pas sur la viabilité et la coloration vitale au bleu trypan sous-estime largement la mortalité. Le double marquage par calcéine-AM (C) et éthidium homodimère (E) permet classiquement de repérer (1) les cellules viables dont les estérases non spécifiques transforment la calcéine en un substrat vert fluorescent et (2) les cellules mortes dont la membrane perméable laisse entrer l’éthidium qui colore les noyaux en rouge. But : présenter des améliorations de cette coloration combinée au marquage nucléaire par Hoechst 33342 (H) par l’utilisation d’un microscope fluorescent 3D appliqué à l’évaluation expérimentale de l’endothélium de cornées humaines entières.Matériels et MéthodesLa face endothéliale était incubée 45 min à 31°C avec 100 μL de C (2 μm), E (5 μm), H (10 μm). Après montage à plat, pour chaque marqueur, les images de la totalité de la surface endothéliale (81 mm²) étaient acquises par microscope IX81, à l’objectif ×4, par platine motorisée XY. Pour chaque position, une pile d’image en Z permettait de récupérer les différences de niveaux dues aux plis endothéliaux. La DCE était mesurée par comptage automatique des noyaux H +, la mortalité par le rapport E +/H +. Les cellules H +/E-/C-, considérées comme non encore mortes mais métaboliquement inactives étaient dénombrées à part.RésultatsLe triple marquage HEC sur la totalité de la surface endothéliale et en 3D permettait une mesure fiable et rapide de la viabilité de la totalité de l’endothélium cornéen, donnant accès à la DCE, au taux de mortalité et à une évaluation de l’activité métabolique.DiscussionLe triple marquage HEC permet de mesurer objectivement les lesions endothéliales à un instant donné et de prendre en compte l’hétérogénéité de répartition des lésions endothéliales.ConclusionSon utilisation améliore et fiabilise l’évaluation expérimentale de tout nouveau procédé susceptible de modifier l’endothélium cornéenex vivo.