L'article développe une méthodologie de recherche basée sur l'utilisation des billes fluorescentes, qui est applicable aux préparations cellulaires ou tissulaires marquées en fluorescence et observées sur des microscopes confocaux à balayage laser. Les billes fluorescentes servent à simuler les fluorochromes et déterminent leur détectabilité dans les préparations. Elles permettent en outre de vérifier que les appareils de mesure sont correctement alignés pour que les images permettant de juger de la co-localisation soient pertinentes. Les méthodes d'analyse factorielle appliquées aux séquences d'images obtenues sur cet appareil permettent de séparer les fluorochromes ayant servi à marquer les sites sur les préparations. Les propriétés physico-chimiques des fluorochromes servent à cette décomposition: spectres d'émission et dynamiques d'extinction. Les séquences d'images sont obtenues soit par sélection spectrale à l'aide d'une série de filtres, soit par balayages successifs de la préparation maintenue immobile. En ce qui concerne l'aspect tridimensionnel, les séquences obtenues par déplacement en profondeur sont décomposées et permettent de restituer les plans d'observation, tout en améliorant la lisibilité des préparations. Ces plans d'observation qui sont décalés en cas de mauvais alignement des sources d'excitation peuvent alors faire l'objet après recalage d'une superposition d'images pour réaliser la co-localisation.